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生物质谱(MALDI-TOF MS)--预防公共卫生事件的有力武器
2020-03-10


1

时光如水,静默不言。

今年的二月显得格外漫长,然三月已悄然开始。走在广州的小街上,又见木棉花开,是那么的美。


看着一个个行人带着口罩,护目镜,有的甚至穿上了“雨衣”防护服,经过医护人员以及全国人民的共同努力,3月8日0-24时全国新增确诊已经降低至40例;截至3月7日12时, 国外累计确诊达21302例。


目前中国的疫情控制已初见成效…但外国形势仍不容乐观…

新冠疫情属于公共卫生突发事件,回顾历史,这类事件时有发生。

01
2008年10月

由霍乱弧菌所致的烈性肠道传染病,在海南大学发生,导致腹痛、腹泻、恶心、呕吐及发热等临床症状,随后海南省先后发生了几起霍乱疫情,特别是2008年10月至11月,海南各市县就确诊霍乱33例,疑似病例和其他肠道传染病超过300例

02
2012年7月

新疆泽普县一起伤寒沙门氏菌引起的食物中毒,导致199人中毒,出现发热恶心呕吐腹泻等临床表现

03
2018年8月

由炭疽杆菌所致的一种人畜共患的急性传染病在黑龙江发生,导致炭疽14例

04
2019年4月

蒙古爆发了由鼠疫杆菌所致的烈性传染病鼠疫,导致2人死亡,169人隔离

......

这些烈性传染病,对人类健康一直是个威胁,面对这些传染病,我们更应该多做的是预防,尽早发现病菌,尽早遏止病菌的传播。



2


随着生物技术的发展,生物质谱的出现大大改变了微生物鉴定的现状。尤其是对炭疽芽孢杆菌、鼠疫菌、霍乱弧菌、伤寒沙门菌、土拉弗朗西斯菌、O157大肠杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、类鼻疽伯克氏菌等具有严重传染性强的致病菌的鉴别。


在生物质谱未应用之前,我们通过生化反应进行微生物鉴定,从纯手工生化反应到自动化判读,再到全自动孵育和判读,鉴定时间从18-24小时缩减到4-8小时,操作实现自动化。生物质谱的出现,实现了鉴定时间从小时变成分钟,并且操作更快捷简便,更适合应对突发事件危害菌种的确认。





(生物质谱鉴定VS生化鉴定)



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生物质谱

发展历史


生物质谱(MALDI-TOF-MS)的发展源于软电离技术MALDI与飞行时间质谱的完美结合。

基质辅助激光解吸电离(MALDI)的发展与ESI几乎在同时期,MALDI是当时的质谱学家们极力寻找适合生物分子的离子化方法,它的起源可追溯到20世纪80年代,1985年德国科学家Micheal Karas与Franz Hillenkamp首次提出以有机小分子为基质增加生物小分子与激光解析法的离子化效率,1987年日本的田中耕一以钴纳米粒子与甘油混合物作为液态基质,并以337nm波长的脉冲激光辐照产生蛋白质分子,该技术被称为软激光解析,田中耕一的工作启发了Micheal Karas与Franz Hillenkamp,Micheal Karas与Franz Hillenkamp通过进一步改良此方法使其成为质谱工作者所熟悉的MALDI。


由于田中耕一对早期研究激光解析在蛋白质电离中的应用上的启发,2002年,田中耕一与另一“软电离”技术电喷雾电离(ESI)同时获得诺贝尔化学奖,这给予了这两项技术极大的肯定。


飞行时间(TOF)质量分析器是一种利用静电场加速后以离子飞行速度差异来分析离子质荷比的仪器,该仪器构想最早于1946年的W.E.Stephens提出,1955年出现第一台商用飞行时间质谱仪。而具有脉冲特性的激光解析电离技术的出现,与脉冲高压推动离子的飞行时间质谱的搭配非常适合。

MALDI的发展,如今已经35年,从那时起,通过应用这一“软电离”技术与飞行时间质谱(MALDI -TOF MS)的结合,成功地实现了为生物大分子提供快速和高度可靠检测手段的目的,同时也为生命科学领域提供了全新的分析方法。


(MALDI-TOF-MS)作为一种快速、可靠的微生物鉴定方法现如今已得到了广泛的应用。尽管MALDI-TOF质谱仪的分辨率相对较低(full width at half maximum, FWHM: < 5,000),且与串联质谱分析不兼容,但它已得到广泛应用。相比其他质谱技术,MALDI-TOF操作简便,不需要接受分析化学培训的专业人员就可以使用。特别是近年来在基因分型分析、生物标志物鉴定、病原体鉴定、质谱成像等应用的发展,越来越被临床等检测领域所青睐。

目前该技术已成为中国国家标准GB/T33682-2017质谱鉴定微生物技术国家标准检测方法。



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生物质谱的
独特性


蛋白质约占细菌干重的50%,其表达由遗传性状决定,受外界环境影响较小,具有多样性、丰富性、易于提取和分离且不需要扩增的特点,因此成为目前MALDI-TOF MS技术检测病原菌的最主要生物标志。

与有机质谱不同的是,生物质谱采用的是MALDI-TOF-MS,该技术可用于蛋白质、核酸、多糖等多种生物分子的测定,其基本原理为:在MALDI离子源部分,基质与样本形成共晶体后,从激光中吸收能量使样本解吸,基质与样本间发生电荷转移使得样本分子电离;在TOF MS分析器部分,离子在电场作用下加速飞过飞行管道,飞行时间与离子的质荷比成正比,根据到达检测器的飞行时间可测出质荷比,通过软件处理就能得到病原菌特征性的指纹图谱。通过分析检测样本菌株蛋白组成成分获得特征性的模式峰,与数据库中细菌指纹图谱进行比较,从而鉴定细菌至属、种,乃至亚种的水平。





(生物质谱原理图)


随着质谱微生物鉴定技术的发展,鉴定准确性更多的是与区分相似遗传背景能力,提高置信度有直接的关联,为了进一步提升质谱鉴定的准确性,目前主要手段是提升数据库质量和优化分析方法。


因此,参考数据库和数据分析方法成为微生物鉴定系统的关键组成部分。菌库模型的建立对鉴定准确性影响较大,美国FDA对建库菌株数量的建议是可鉴定菌种至少需要大于5株才可确保鉴定准确性,因此每种菌的建立过程采用不同来源的菌株,更能代表每种菌的实际蛋白图谱。


另一方面是每种菌的蛋白图谱采用权重算法把微小的蛋白表达差异都按照权重计算入内,这对于种间差异小的难鉴别的细菌间的鉴别尤为重要。


生物质谱的
快速便捷性


“便捷、快速、准确”是生物质谱鉴别微生物与传统生化方式鉴别微生物最大的差别。

生物质谱操作简便,不需要接受分析化学培训的专业人员就可以使用。只需三步骤(通用方法)就能获取鉴定结果:


第一步:实验材料准备





(靶板:每个靶板有48个点位,16个点位为一组,可分3次使用;每组中心的小点位只用于涂校准菌株大肠埃希菌ATCC 8739







(试剂:
CHCA基质)

  (试剂:
甲酸)




其他材料:校准菌株(大肠埃希菌ATCC8739)、1μL塑料接种环(用于取菌和涂靶板)加样器(可调范围0.5 –2.5μL)及加样头、质控菌株(产气肠杆菌ATCC 13048光滑假丝酵母ATCC MYA-2950


第二步:涂菌

涂菌和加基质是关键步骤,建议涂菌后立刻加基质,便于基质穿透细菌涂层


第三步:上机检测





每个样本只需1-2分钟完成,鉴定准确性高达97.29%(FDA最新更新数据显示




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